Ddavp 72

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Vasopressin-induzierte Faktor von Willebrand-Sekretion von Endothelzellen umfasst V2-Rezeptoren und cAMP 1 Abteilung für Klinische Biochemie, Genf, Schweiz 2 Forschungsinstitut für Molekulare Pharmakologie, Berlin, Deutschland Korrespondenzadresse: Jocelyne E. Kaufmann, Division de Biochimie Clinique, CMU, 1, rue Michel Servet, 1211 Genf 4, Schweiz. Telefon: 41-22-702-55-58; Fax: 41-22-702-55-43; E-mail: kaufmann@cmu. unige. ch. 1 Abteilung für Klinische Biochemie, Genf, Schweiz 2 Forschungsinstitut für Molekulare Pharmakologie, Berlin, Deutschland Korrespondenzadresse: Jocelyne E. Kaufmann, Division de Biochimie Clinique, CMU, 1, rue Michel Servet, 1211 Genf 4, Schweiz. Telefon: 41-22-702-55-58; Fax: 41-22-702-55-43; E-mail: kaufmann@cmu. unige. ch. 1 Abteilung für Klinische Biochemie, Genf, Schweiz 2 Forschungsinstitut für Molekulare Pharmakologie, Berlin, Deutschland Korrespondenzadresse: Jocelyne E. 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Kaufmann, Division de Biochimie Clinique, CMU, 1, rue Michel Servet, 1211 Genf 4, Schweiz. Telefon: 41-22-702-55-58; Fax: 41-22-702-55-43; E-mail: kaufmann@cmu. unige. ch. Erste 1 Januar erschien 2000 - Mehr Infos Veröffentlicht in Band 106, Heft 1 (1. Juli 2000) J Clin Invest. 2000; 106 (1): 107-116. doi: 10,1172 / JCI9516. 2000 Die American Society for Clinical Investigation. Veröffentlicht 1. Juli 2000 empfangen: 2. Februar 2000; Akzeptiert: 30 Mai 2000 Vasopressin und seine analogen 1-Deamino-8- D - Arginin Vasopressin (DDAVP) sind dafür bekannt, Plasma-von-Willebrand-Faktor (vWF) Spiegel erhöhen. DDAVP ist als hämostatisches Mittel zur Behandlung der von Willebrand-Krankheit verwendet. Allerdings haben seine zellulären Wirkmechanismen nicht aufgeklärt. DDAVP, ein spezifischer Agonist für die Vasopressin-V2-Rezeptor (V2R), übt seine antidiuretic Wirkung über einen Anstieg der cAMP in Nierensammelkanälen. Wir testeten die Hypothese, dass DDAVP vWF-Sekretion durch die Bindung an V2R induziert und Aktivierung von cAMP-vermittelten Signaltransduktion in Endothelzellen. vWF-Sekretion aus menschlichen Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs) kann durch cAMP vermittelt werden, aber DDAVP ist unwirksam, wahrscheinlich aufgrund des Fehlens von V2R. Wir berichten, daß DDAVP stimuliert vWF-Sekretion in einem cAMP-abhängige Weise in HUVECs nach Transfektion des V2R. Darüber hinaus, Vasopressin und DDAVP vWF-Sekretion in der menschlichen Lunge mikrovaskulären Endothelzellen (HMVEC-L) zu induzieren. Diese Zellen (aber nicht HUVECs) exprimieren endogene V2R, wie durch RT-PCR gezeigt. Vasopressin-induzierte vWF-Sekretion wird durch DDAVP und gehemmt durch die selektive V2R Antagonist SR121463B nachgeahmt. Es wird von cAMP vermittelt, da sie durch die Proteinkinase A-Inhibitor Rp-cAMPS 8CPT-inhibiert wird. Diese Ergebnisse zeigen, daß Vasopressin cAMP-vermittelte vWF-Sekretion durch eine direkte Wirkung auf Endothelzellen induziert. Sie zeigen auch die funktionelle Expression von V2R in Endothelzellen und bieten einen zellulären Mechanismus für die hämostatische Wirkung von DDAVP. von Willebrand Faktor (vWF) ist ein Glykoprotein, das Klebstoff eine wichtige Rolle bei der primären Hämostase spielt, d. h., die Adhäsion von Blutplättchen an das Subendothel vaskulären (1. 2). Es ist auch ein Plasma-Trägerprotein für Gerinnungsfaktor VIII (FVIII). Zirkulierende vWF wird durch das vaskuläre Endothel erzeugt, mit einem geringen Beitrag von Blutplättchen / Megakaryozyten (3). In Endothelzellen (ECs) wird der vWF synthetisiert, gespeichert und von spezialisierten Sekretgranula genannt Weibel-Palade (WP) Körper (4) veröffentlicht. Quantitative oder qualitative vWF-Mangel verursacht von-Willebrand-Krankheit (vWD), eine gemeinsame erbliche Blutgerinnungsstörung (1. 2). Es ist bekannt, dass 8-Arginin-Vasopressin (AVP) und sein Analog 1-Deamino-8- D - Arginin Vasopressin (DDAVP) erhöhen zirkulierende vWF und FVIII Ebenen. Tatsächlich sind sie für die Behandlung von vWD und anderen Blutungsstörungen (5) weit verbreitet. Doch nach mehr als 20 Jahren der klinischen Anwendung, die zellulären Mechanismen für die hämostatische Wirkung des DDAVP noch schwer (6). Es ist bekannt, daß im Gegensatz zu AVP, die zu drei zelluläre Rezeptoren bindet (V1a, V1b, V2), DDAVP für den V2-Rezeptor (V2R) ein selektiver Agonist ist. Dieser Vasopressin-Rezeptor-Subtyp ist in den Hauptzellen des Nierensammelkanäle und vermittelt die antidiuretischen Wirkung des Hormons (7. 8) ausgedrückt. DDAVP versagt eine Zunahme der zirkulierenden vWF bei Patienten mit X-chromosomal Diabetes insipidus zu verursachen, die eine Mutation in dem V2R besitzen (9 bis 11). bei Patienten mit chronischer jedoch Nierenversagen, wirft DDAVP Plasma vWF auch nach bilateraler Nephrektomie (12). Diese klinischen Beobachtungen legen nahe, die Beteiligung der extrarenalen V2R. Die einfachste Hypothese wird dann, dass DDAVP direkt V2R an Endothelzellen bindet, induziert eine schnelle vWF Sekretion von WP Körper. Jedoch hat extrarenale Expression eines funktionellen V2R noch nicht nachgewiesen worden. Des Weiteren haben mehrere Gruppen gescheitert DDAVP-induzierte vWF-Sekretion in kultivierten ECs (13-15) zu demonstrieren. Eine alternative Hypothese ist, dass DDAVP auf einer Zwischenzelle wirkt, die eine "vWF-Releasing-Hormon" freigibt, die dann auf ECs wirkt (16). Allerdings bleiben die Existenz und Identität eines solchen Hormons nur schwer fassbar. Acute vWF-Freisetzung aus WP Körper in kultivierten menschlichen Nabelvene ECs (HUVECs) durch Rezeptor-Agonisten induziert wird, welche Thrombin und Histamin umfassen, durch eine Erhöhung der cytosolischen freien Ca 2+ wirkt ([Ca 2+] i) (17 - 19). Ihre Wirkung wird durch die intrazelluläre Calciumchelatoren blockiert und durch Calcium-Ionophore nachgeahmt, die darauf hindeuten, dass der Anstieg der [Ca 2+] i in der Tat vermittelt vWF-Sekretion (17). Eine zweite Gruppe von Agonisten, über eine Erhöhung der intrazellulären cAMP ([cAMP] i) handelt, wurde ebenfalls berichtet. Forskolin, einem Aktivator der Adenylylcyclase (AC), bewirkt eine Erhöhung der vWF-Sekretion in HUVECs, unabhängig von einem Anstieg in [Ca 2+] i. Dieser Effekt wird durch IBMX potenziert, fügte ein Phosphodiesterase-Hemmer cAMP-Abbau (13) zu verhindern. Adenosine, Epinephrin und Prostazyklin induzieren vWF-Sekretion in einer cAMP-abhängigen Weise (13. 20. - 22.). In den Hauptzellen der Nierensammelrohre, AVP oder DDAVP Aktivierung des V2R verursacht Wassereinlagerungen ( "Antidiurese") durch die Verlagerung des Wasserkanals Aquaporin-2 aus intrazellulären Lagern zur apikalen Plasmamembran zu induzieren. Dieser Mechanismus stellt ein Beispiel für cAMP-vermittelten Exozytose (23). Die bisherige Arbeit hat gezeigt, dass HUVECs exprimieren alle molekularen Maschinen für die cAMP-vermittelte Sekretion: nur die V2R fehlt DDAVP-induzierte vWF Veröffentlichung zu ermöglichen. Doch sein HUVECs möglicherweise nicht repräsentativ, weil entweder der Entdifferenzierung in Kultur oder wegen der phänotypischen Unterschiede zwischen den ECs. In dieser Studie untersuchten wir die Hypothese, dass die V2R-abhängige cAMP-vermittelte vWF Sekretion von Gefäßbetten andere als HUVECs in ECs auftritt. Wir unternahmen erste DDAVP-induzierte Sekretion vWF durch Transfektion der V2R in HUVECs und durch Untersuchung der zweiten Boten einbezogen zu rekonstituieren. Anschließend identifizierten wir DDAVP-induzierte vWF-Sekretion und V2R-Expression in ECs Lunge mikrovaskulären. Materialien. AVP, DDAVP, 3-Isobutyl-1-methyl-xanthin (IBMX) und Forskolin wurden von Sigma (St. Louis, Missouri, USA). Rp-8CPT-LAGER (24), war von BIOLOG Life Science Institute (Bremen, Deutschland). SR121463B wurde freundlicherweise von C. Serradeil-Le Gal (Sanofi Recherche, Toulouse, Frankreich) (25) zur Verfügung gestellt. Anti-vWF-Antikörper wurden von DAKO (Glostrup, Dänemark) gekauft und Rhodamin-konjugiertes Ziegen-anti-Kaninchen-Antikörper von Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. (West Grove, Pennsylvania, USA). Zellkulturreagenzien wurden bereits beschrieben (20). Zellkultur. Primärkulturen von ECs (HUVECs) wurden aus Pools von einzelnen menschlichen Nabelvenen durch Kollagenase-Verdau und gezüchtet in RPMI-1640-Medium, ergänzt mit 10% FCS, 90 ug / ml Heparin erhalten wurde, und 15 ug / ml ECGS, wie zuvor beschrieben (26 ). Die Zellen wurden während der Passagen 1 oder 2 verwendet wird. Primärkulturen von humanen mikrovaskulären ECs aus Lunge (HMVEC-L), erworben von Clonetics (Walkersville, Maryland, USA), wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers gezüchtet und in den Durchgängen 5 bis 8. Fünf Chargen von drei Spendern wurden verwendet. Diese Zellen haben eine typische pflastersteinartige Morphologie und Flecken positiv für acetyliertes LDL und CD31. Mehr als 90% der Zellen zeigen typische WP Körper (siehe Abbildung 4). Immunfluoreszenzfärbung für vWF in HUVECs (a) und HMVEC-L-Zellen (b). Die Zellen wurden fixiert, permeabilisiert und gefärbt mit Anti-vWF-Antikörper, wie in Abbildung 1. Beide Zelltypen enthalten ähnliche Anzahl von typischen WP Körper. Bar, 20 um. Transfektion von HUVEC. Das Fusions pV2R. EGFP des Wildtyp V2R zur NH 2 - Terminus des autofluoreszierenden rotverschoben Variante des grün fluoreszierenden Proteins (EGFP) - Konstrukt zuvor beschrieben wurde (27). Ein Kontroll-Plasmid, pA295.EGFP, abgeschnitten das V2R kodierend nach der sechsten Transmembrandomäne (A295, eine natürlich V2R Mutation in einem Patienten mit X-chromosomal Diabetes insipidus, unsere unveröffentlichte Beobachtungen gefunden vorkommende) und fusioniert mit EGFP wurde durch PCR erzeugt. Das V2R. EGFP Plasmid wurde mit dem Primer amplifiziert STV2 (5'-CCCCAGCCCCACCATGCTCATGGCGTCC-3 ', entsprechend den Nukleotiden -13 bis +15 der cDNA-Sequenz durch ref als bewertet. 7) und dem Antisense-Primer A295 Bam HALLO (5'-TATGGATCCGCGGCCCACAGCTGCACCAGG -3 ', Nukleotide 896-917 plus acht Nukleotiden eine Bam HALLO Restriktionsstelle einzuführen). Das resultierende PCR-Fragment wurde mit Pst I / Bam HALLO geschnitten und in das pV2R. EGFP Plasmid kloniert. Das resultierende Plasmid wurde durch automatisierte DNA-Sequenzierung verifiziert. In COS-Zellen wurde die transfizierten Fusionsprotein exprimiert wurde aber funktionell inaktiv (nicht veröffentlichte Beobachtungen). Die pV2R. EGFP oder pA295.EGFP wurden vorübergehend in fast konfluente HUVEC transfiziert mit dem Polyamin Transfektionsreagenz TRANSIT-LT2 (Panvera, Madison, Wisconsin, USA). Die Zellen wurden 1 Tag vor der Transfektion in Sechs-Well-Platten aufgeteilt, und jede Vertiefung wurde mit 1 ug DNA und 6 & mgr; l in RPMI-1640 verdünnt von TRANSIT-LT2 transfiziert. Das Transfektionsgemisch wurde mit den Zellen in RPMI-1640 mit 10% FCS decomplemented und 15 ug / ml ECGS (aber ohne Heparin) für 4 Stunden bei 37 ° C ergänzt inkubiert. Es wurde dann durch frisches komplettes Kulturmedium ersetzt. FACS-Sortierung der EGFP-positiven Zellen. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen trypsinisiert und in Krebs-Ringer-Bicarbonat-Puffer (KRBH; pH 7,4, enthaltend 25 mM HEPES, 5,5 mM Glucose und 0,1% BSA) in einer Konzentration von 0,5-1 × 10 6 Zellen / mL. EGFP-positiver und negativer Zellen, bei 4 ° C gehalten wird, wurden unter Verwendung eines FACStar-Plus (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, Kalifornien, USA) mit einem Argon-Laserstrahl bis 488 nm bei etwa 40 mW Ausgangs abgestimmt sortiert. Die Sortierparameter waren die EGFP-Fluoreszenz mit einem 530 Plus gemessen oder minus 25-nm-Filter und die zelluläre Größe wie die Vorwärtsstreuung gemessen. Sortierte Zellen wurden bei einer Mindestdichte von 40 in 48-well Platten ausgesät × 10 3 Zellen / Vertiefung. Studium der vWF-Sekretion in ECs. Secretion Studien wurden in KRBH und vWF wurde durch ELISA gemessen, durchgeführt wird, wie zuvor (26) beschrieben. In HMVEC-L-Zellen lag die basale Freisetzung über 30 Minuten von 0,3 bis 1,7 ng / cm 2 Diese Werte sind vergleichbar mit denen für HUVECs in früheren Studien beobachtet (13. 20). Aufgrund der Veränderungen in Basalfreisetzung, vWF-Sekretion wird in relativen Werten, mit vWF Veröffentlichung berichtet von nicht-stimulierten Zellen als 100% definiert. Die Messungen von cAMP. Zellmonoschichten wurden in eiskaltem 70% Ethanol extrahiert, und die Proteine ​​wurden aus den Extrakten durch Zentrifugation abgetrennt. Die Extrakte wurden in einem Speedvac (Savant Instruments Inc. Holbrook, New York, USA) getrocknet und in 0,05 M Acetatpuffer resuspendiert. Die cAMP wurde unter Verwendung eines kommerziellen Radioimmunoassays (Amersham, Little Chalfont, Vereinigtes Königreich) quantifiziert. Immunofluoreszenz. HUVECs gezüchtet und transfiziert auf Glasdeckgläser wurden in 3,7% Formaldehyd fixiert und mit 0,5% Triton X-100 in phosphatgepufferter Kochsalzlösung permeabilisiert. Der vWF wurde durch aufeinanderfolgende Inkubation sichtbar gemacht mit gereinigtem anti-vWF-Antikörper (2 & mgr; g / ml) und mit Rhodamin-konjugiertem Ziege-anti-Kaninchen-Antikörper, verdünnt 1: 400. Die Objektträger wurden mit einem invertierten Zeiss-Axiovert 100 Fluoreszenzmikroskop (Carl Zeiss, Jena, Deutschland) untersucht. Bilder wurden mit einem Hamamatsu C4742-95-10 digital ladungsgekoppeltes Bauelement (CCD) Kamera (Hamamatsu Photonics, Osaka, Japan), gesteuert durch die Software Openlab (Improvision, Oxford, Vereinigtes Königreich) erworben. Isolierung von mRNA. Gesamt-RNA wurde aus HMVEC-L, HUVECs oder Lungengewebeproben unter Verwendung von Trizolreagenz (GIBCO BRL, Gaithersburg, Maryland, USA) isoliert. Lungengewebe wurde aus dem tumorfreien Bereich pneumonectomy Proben reseziert für Lungenkarzinom gesammelt, freundlicherweise von L. Nicod und S. Kantengwa (Department of Medicine, University Hospital, Genf, Schweiz). Normalen adulten menschlichen Niere Gesamt-RNA wurde von Clontech Laboratories Inc. (Palo Alto, Kalifornien, USA) erhalten. Isolierung von polyA + RNA (120-150 ug Gesamt-RNA) wurde durchgeführt, die Oligotex mRNA Kit der Firma Qiagen (Hilden, Deutschland) verwendet. RT-PCR-Analysen von V2R Ausdruck. RT-PCR wurde durchgeführt unter Verwendung der Ein-Rohr, zwei Enzym Zugang RT-PCR-System von Promega (Madison, Wisconsin, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Primer für die Amplifikation der V2R-Sequenz (aus Lit. geändert. 28) wurden von Microsynth (Balgach, Schweiz) erhalten: V2Rc 5'-CCGCTTCCGTGGGCCAGATGC-3 '(Sense-Strang, Positionen 309-329) und V2Rd 5'-GGCAGCTGAGCTTCTCAAAGCC-3' (Antisense, Positionen 1144-1165). Diese Primersequenzen sind lokalisiert in Exon 2 und im 3'-UTR des Gens V2R, respectively. Die RT-PCR-Programm beinhaltete eine 45-minütige Inkubation bei 48 ° C (Erststrang-DNA-Synthese), gefolgt von einer 2-minütigen Denaturierungsschritt bei 94 ° C, 40 Zyklen von 30 Sekunden Denaturierung bei 94 ° C, 1 Minute Annealing bei 65 ° C, 2 Minuten Verlängerung bei 68 ° C, und von einer letzten 7 Minuten Verlängerung bei 68 ° C. Primer für die Aktin-mRNA-Amplifikation wurden zuvor (29) beschrieben. PCR-Produkte wurden auf 1,5% Agarosegelen aufgelöst, isoliert QIAquick PCR-Reinigungs-Kit (QIAGEN) und direkt sequenziert Primer V2Rc und V2Rd verwenden. In einem zweiten Satz von Experimenten wurde die V2R-Sequenz in voller Länge wurde aus menschlicher Lungen-polyA + RNA durch RT-PCR unter Verwendung des Sense-Primers STV2 (oben beschrieben) und der Antisense-Primer V2R Bam HALLO (5'-GACACCCAACGGATCCTCACGATGAAGTG-3 'amplifiziert, Nukleotiden 1104 bis 1132 der cDNA, mit Einführung einer Restriktionsstelle BamHI HALLO). RT wurde mit dem Superscript Preamplification Systems (GIBCO BRL) durchgeführt, unter Verwendung von Oligo (dT) 12-18 (ohne oder mit vorheriger Behandlung der RNase-freie DNaseI). RNA wurde aus RNA / cDNA-Hybride mit RNase H. PCR wurde entfernt mit AmpliTaq-Polymerase durchgeführt wird. Die Reaktionsmischungen wurden für 30 Sekunden bis 40 Zyklen von 94 ° C vorgelegt, 60 ° C für 30 Sekunden und 72 ° C für 1 Minute, gefolgt von einer abschließenden Verlängerungsschritt von 7 Minuten. Die PCR-Fragmente wurden in den pCR 2.1-Vektor durch Transformation in One Shot kompetente Zellen (Invitrogen, Leek, Holland TA Cloning Kit) gefolgt subkloniert. Die resultierenden Plasmide, die verschiedenen PCR-Fragmente beherbergen, wurden vollständig sequenziert. Southern-Blot-Analyse der RT-PCR-Produkte wurde wie in Referenz 30. Die Proben (entsprechend 0,1% der RT-PCR-Reaktion für HMVEC-L und HUVEC und 0,02% für Nieren - und Lungenproben, jeweils), um ein übertragenes beschrieben durchgeführt Nytran-Membran (Amersham Pharmacia Biotech) wurden mit einer [32 P] - dCTP hybridisierten markierten Sonde 357 bis 1011 der cDNA V2R den Nukleotiden entsprechen, die durch Verdau von pV2R. EGFP mit Pst erhalten, I und Hin dIII. Wirkung von DDAVP auf vWF-Freisetzung aus HUVECs exprimierenden V2R. EGFP. Um DDAVP Ansprechbarkeit Rekonstitution pV2R. EGFP oder pA295.EGFP (Codierung für die Expression von Wildtyp V2R oder inaktiven Trunkierungsmutante A295, jeweils) wurden vorübergehend in HUVECs transfiziert. Exprimierenden Zellen V2R. EGFP, aber nicht diejenigen A295.EGFP exprimierenden zeigte ein Expressionsmuster typisch für Plasmamembran Kennzeichnung (Abbildung 1). Zusätzlich ist jeder der beiden Konstrukte zeigten intrazelluläre Markierung, wahrscheinlich zu reflektieren Retention des Proteins in dem RER und / oder in den Golgi-Apparat (27) exprimierenden Zellen. Die Transfektion führte zu keiner Abreicherung von WP Körpern, wie durch Immunfärbung für vWF (Figur 1) offenbart. Expression von V2R. EGFP oder A295.EGFP in HUVECs und Immunofluoreszenz-Färbung der Zellen für vWF. HUVECs wurden mit pV2R. EGFP oder pA295.EGFP transfiziert. Verwendung von Anti-vWF-Antikörper, gefolgt von Rhodamin-konjugiertes Ziegen-anti-Kaninchen-Antikörper Vierundzwanzig Stunden später wurden sie fixiert, permeabilisiert, und gefärbt. Bilder zeigen EGFP Fluoreszenz von HUVECs exprimierenden V2R. EGFP (a) oder A295.EGFP (b) und die Verteilung von vWF in WP Körper in den gleichen Zellen (c) und (d), respectively. Membran-Markierung mit EGFP wurde nur in Zellen, die V2R. EGFP gesehen, während perinukleäre Markierung mit beiden Konstrukten zu sehen war. Bar, 20 um. Die Transfektionseffizienz von 25% und 10% der Zellen, die pV2R. EGFP und pA295.EGFP Konstrukte jeweils gemessen als die EGFP-positiven Zellen durch FACS erreicht (nicht gezeigt). Die geringere Effizienz mit dem mutierten Rezeptor erhalten wird, ist wahrscheinlich in der RER zu einem Abbau zurückzuführen. Transfizierte Zellen V2R oder die A295-Mutante exprimieren, wurden durch FACS unter Verwendung von EGFP-Fluoreszenz sortiert. EGFP-positiven und - negativen Zellen wurden 72 Stunden nach Kultur zurückgegeben. Diese Zellpopulationen wurden dann für 1 Stunde in Gegenwart von 100 & mgr; M IBMX inkubiert, entweder allein oder in Gegenwart von entweder 0,1 uM DDAVP oder 10 uM Forskolin (ein Aktivator der AC) als positive Kontrolle. Die Freisetzung von vWF in das Medium wurde mittels ELISA (Figur 2) gemessen. DDAVP-vermittelte vWF-Sekretion aus Zellen, die V2R. EGFP. HUVECs wurden mit pV2R. EGFP oder pA295.EGFP transfiziert. Achtundvierzig Stunden später EGFP-positiven und - negativen Zellen wurden durch FACS sortiert und ausgesät in 48-Well-Platten. Zweiundsiebzig Stunden später wurden sie für 1 Stunde inkubiert in KRBH enthaltend 100 & mgr; M IBMX allein (offene Balken) oder in Gegenwart von entweder 0,1 uM DDAVP (schraffierte Balken) oder 10 & mgr; M Forskolin (gefüllte Balken). Dann vWF in den Medien wurde durch ELISA gemessen. Die Ergebnisse werden als Prozentsatz des vWF in basalen Bedingungen (IBMX allein) sezerniert gezeigt. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM für sechs unabhängige Experimente. (A P 0.001 Student paired t-Test). HUVECs exprimierenden V2R. EGFP zeigte einen signifikanten Anstieg der vWF-Sekretion nach Inkubation mit DDAVP (100-243%; n = 6, P 0,01 für beide Substanzen). DDAVP-induzierte vWF-Sekretion aus Zellen V2R exprimiert, wurde noch nach der Inkubation beobachtet, die mit niedrigeren Konzentrationen dieser Agonisten. Inkubation mit 0,1 nM DDAVP eine halbmaximale Stimulation von vWF Freisetzung induziert (Daten nicht gezeigt). DDAVP allein stimuliert auch vWF-Sekretion aus Zellen, die V2R. EGFP, obwohl auf einem niedrigeren Niveau als in der Gegenwart von IBMX (bis 150%), aber nicht von nicht-transfizierten Zellen (nicht gezeigt). Inkubation mit IBMX allein beeinflußte vWF-Sekretion nicht wesentlich, wie bereits festgestellt (13). DDAVP induzierte keine signifikante Freisetzung von vWF aus untransfizierten HUVECs oder von Zellen, die das mutierte Rezeptorkonstrukt A295.EGFP exprimierenden, was bestätigt, dass DDAVP-induzierte Sekretion vWF das Ergebnis der funktionellen Expression von transfizierten V2R ist. Wirkung von DDAVP auf [cAMP] i von HUVECs exprimierenden V2R. EGFP. Wir stellten fest, als nächstes, ob DDAVP-induzierte vWF Freisetzung in V2R-exprimierenden HUVECs von cAMP vermittelt wird. Wir begannen mit der [cAMP] Messung i durch Radioimmunoassay in Zellen V2R oder Kontrollzellen exprimieren (Abbildung 3 a). In Zellen mit 0,1 uM V2R. EGFP DDAVP (zusammen mit 100 & mgr; M IBMX) inkubiert exprimieren, [cAMP] i erhöht auf 375 plus oder minus 83% im Vergleich mit IBMX inkubiert Zellen allein (n = 4, P 0,05 für jede Zellpopulation) . Somit DDAVP-induzierte Sekretion vWF wird durch einen Anstieg der [cAMP] i in HUVECs exprimierenden V2R parallel. DDAVP vermittelt vWF-Sekretion durch einen Anstieg der [cAMP] i in Zellen, die V2R. EGFP. (A) DDAVP-vermittelte Erhöhung der [cAMP] i in Zellen, die V2R. EGFP. HUVECs mit V2R transfiziert wurden wie in Abbildung 2 sortiert EGFP-negativen Zellen als Kontrollen verwendet wurden behandelt. Am Ende der Inkubationen (mit 100 & mgr; M IBMX, allein [offene Balken], in Gegenwart von 0,1 uM DDAVP [schattierten Balken] oder von 10 uM Forskolin [gefüllte Balken]) cAMP wurde durch Radioimmunoassay extrahiert und quantifiziert. Die Ergebnisse werden als Prozentsatz der [cAMP] i in basalen Bedingungen (IBMX allein) gezeigt. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM von vier unabhängigen Experimenten. (A P 0,05 von Student paired t-Test). Als nächstes testeten wir die Wirkung von Rp-cAMPS 8CPT-(24), das für seine Bindungsstelle auf die Proteinkinase A (PKA) mit cAMP konkurriert. In Gegenwart von Rp-cAMPS 8CPT-(0,5 mM) wurde die sekretorische Antwort auf Forskolin um 51 und verringert oder minus 19% in Zellen V2R exprimierende (n = 5, P 0,01). Keine signifikante Wirkung des Inhibitors auf Zellen mit IBMX allein oder auf nicht-transfizierten Zellen mit DDAVP (nicht gezeigt) inkubiert nachgewiesen werden konnte. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, daß DDAVP-induzierte Sekretion vWF durch einen Anstieg der [cAMP] vermittelt wird i. wie es ist, für die Forskolin-vermittelte vWF-Sekretion. DDAVP-induzierte cAMP-abhängige vWF Sekretion von HMVEC-L-Zellen. Die Experimente zeigen gerade beschrieben, die V2R Ausdruck genügt DDAVP-induzierte vWF-Sekretion in HUVECs zu rekonstruieren. Diese Beobachtungen werfen die Möglichkeit, dass Vasopressin-induzierte vWF-Sekretion, vermittelt durch die V2R und cAMP-abhängige Signal, in ECs ist von Gefäßbetten andere als HUVECs. Um diese Hypothese zu adressieren, die wir getestet mikrovaskuläre ECs aus der menschlichen Lunge, HMVEC-L. Verwendung von indirekter Immunofluoreszenz mit sowohl Anti-vWF (Figur 4) und anti-Propeptid: in Zahlen enthalten WP Körpern vergleichbar mit denen in HUVECs gesehen Antikörper (vWF AgII, nicht gezeigt), wurden HMVEC-L gefunden. HMVEC-L in konfluenten Monoschichten gezüchtet wurden mit Forskolin bei 37 ° C für 30 Minuten inkubiert, AVP (1 uM) oder DDAVP (1 uM), in Abwesenheit oder Gegenwart von IBMX (Figur 5 a). Die Dosen von AVP und von DDAVP wurden ausgewählt, um maximale Stimulation von AC (7) erhalten. Forskolin, verwendet als positive Kontrolle, induzierte eine größer als das Neunfache Erhöhung vWF-Sekretion, ob in Anwesenheit oder Abwesenheit von IBMX. Sowohl AVP und DDAVP verursacht eine kleine, aber signifikante Erhöhung der vWF-Sekretion (von 100% auf 187 ± 26%, n = 4, und 147 ± 21%, n = 10, p 0,05) nach AVP. Dies stellt eine 1,9- und 2,7-fachen Anstieg in Reaktion auf DDAVP und AVP, respectively. Der geringe Anstieg in Reaktion allein IBMX war nur marginal signifikant (P = 0,1), weil es eindeutig in nur einer der Zellchargen getestet wurde beobachtet. Vasopressin-induzierte cAMP-abhängige vWF Sekretion von HMVEC-L-Zellen. (A) Konfluente HMVEC-L in 12-Well-Platten gezüchtet wurden 30 Minuten lang in Gegenwart von DDAVP (1 uM) in KRBH inkubiert, AVP (1 uM), Forskolin (Forsk; 10 uM) oder KRBH allein (Contr) . Die Experimente wurden in Abwesenheit oder Gegenwart von 100 & mgr; M IBMX und vWF freigesetzt im Inkubationsmedium wurde getestet durch ELISA durchgeführt wird. Die Ergebnisse werden dargestellt als relative Werte, Freisetzung von Kontrollzellen als 100% definiert ist. Die Daten sind der Mittelwert ± SEM von 10 (DDAVP und Forskolin) oder vier (AVP) Experimenten. (A P 0,02 von Student paired t-Test). Adresse weiter die Beteiligung von cAMP-abhängige Signalgebung in DDAVP-induzierte Sekretion wurden die Sekretion Experimente in der Gegenwart des Inhibitors PKA wiederholt Rp-cAMPS 8CPT-(Figur 5 b). HMVEC-L wurden vorinkubiert mit Rp-8CPT-cAMPS in einer Konzentration von 0,2 mM für 30 Minuten vor der Inkubation mit Forskolin, Thrombin oder DDAVP für 30 Minuten. Rp-cAMPS 8CPT-blockierte vollständig die Antwort auf Forskolin, aber nicht als Kontrolle verwendet zu Thrombin [Ca 2+] i Mittel - raising. So Rp-8CPT-cAMPS hemmt selektiv die cAMP-vermittelte aber nicht [Ca 2+] i - vermittelte Sekretion vWF. DDAVP-induzierte wurde vWF-Sekretion durch dieses Mittel vollständig gehemmt, die das Signal cAMP-abhängige bestätigt wird bei der Reaktion auf DDAVP beteiligt. Wir führten auch eine direkte Messung der zellulären cAMP-Gehalt (nicht gezeigt). Obwohl 10 uM Forskolin (zusammen mit 100 & mgr; M IBMX) eine 5,0-induzierte plus oder minus 1,8-fachen Anstieg der [cAMP] i (P = 0,006, n = 5), keine signifikante Erhöhung der Reaktion auf entweder DDAVP oder IBMX allein hinzugefügt wurde gemessen . Allerdings DDAVP (1 uM) zugegeben zusammen mit IBMX einen signifikanten Anstieg von 20% in [cAMP] verursacht i im Vergleich mit IBMX allein (von 745 ± 192 bis 887 ± 239 fmol / Well; P = 0,01, n = 5). Dieser nur moderate Erhöhung kann durch die kleine sekretorischen Wirkung und die Variabilität der cAMP-Extraktion und Messungen erläutert werden. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, daß DDAVP-induzierte Sekretion vWF in HMVEC-L durch cAMP-abhängige Signalisierung vermittelt wird. AVP-induzierte vWF-Sekretion in HMVEC-L-Zellen: Beteiligung von V2R. Die Beteiligung von V2R in cAMP-vermittelte vWF Sekretion DDAVP-induziert wurde in Experimenten unter Verwendung des selektiven V2R Antagonist SR121463B (25) gerichtet. HMVEC-L-Zellen wurden mit SR121463B (100 uM) inkubiert zusammen mit IBMX (100 uM). Nach 5 Minuten AVP (1 uM) oder Adenosin (100 & mgr; M, als Kontrolle cAMP-Erhöhung Sekretion Agonist verwendet wird) wurde während 30 Minuten zugegeben und gelöst vWF wurde durch ELISA gemessen. SR121463B hatte keinen signifikanten Einfluss auf vWF Basalfreisetzung. Doch dieser Antagonist völlig gehemmt AVP-induzierte vWF-Sekretion. Wir haben auch einen signifikanten Anstieg der vWF-Sekretion als Antwort auf Adenosin (100 uM) beobachtet, die nicht durch Vorbehandlung SR121463B gehemmt wurde (nicht gezeigt). Somit zeigt SR121463B spezifisch AVP-induzierte Sekretion vWF inhibiert, dass die Wirkung von AVP durch V2R vermittelt wird. Expression von V2R in HMVEC-L. Um die Beteiligung von V2R in AVP-induzierte Sekretion bestätigen, überprüften wir die Expression dieses Rezeptors in HMVEC-L durch RT-PCR. Dazu isolierten wir polyA + RNA aus diesen Zellen. PolyA + RNA aus der Niere und von HUVECs wurde auch als positive und negative Kontrollen isoliert. Vorhandensein und die Integrität der mRNA-Proben wurde unter Verwendung von Aktin-Primer für die RT-PCR durchgeführt. Das erwartete 236-bp-Bande wurde in allen Proben erhalten, wie erwartet (nicht gezeigt). Demonstration of V2R mRNA-Expression wurde unter Verwendung von Primern und V2Rc V2Rd erreicht, entworfen, um eine 857-bp-Sequenz überspannt Exons 2 und 3. Eine Bande der erwarteten Größe erhalten von beiden Nieren und HMVEC-L RNA (6 a) zu verstärken. Direkte Sequenzierung beider Banden ergaben eine 100% ige Homologie mit der veröffentlichten Sequenz des menschlichen V2R (7). Diese Bande wurde nicht beobachtet, wenn die Reaktion in Abwesenheit von RT durchgeführt wurde. Es wurde auch von HUVEC RNA nicht amplifiziert. Diese Ergebnisse legen nahe, dass V2R mRNA vorhanden ist, in HMVEC-L, aber nicht in HUVECs, wie aus den Sekretion Experimente vorhergesagt. Eine größere Bande von etwa 960 bp wurde von allen Proben mRNA amplifiziert und wurde ebenfalls festgestellt, wenn die Reaktion in Abwesenheit von RT durchgeführt wurde. Die Sequenzierung dieser Band aus der HUVEC Probe amplifiziert identifiziert die V2R-Sequenz, einschließlich der gesamten zweiten Intron. Dieses Band stellt somit Verunreinigung genomischer DNA. Zusätzliche RT-abhängige Banden mit niedrigerem Molekulargewicht wurden ebenfalls für alle Proben erhalten. Eine Southern-Blot-Analyse eine Sonde, die von V2R cDNA unter Verwendung festgestellt, dass diese Bänder an die V2R-Sequenz (Abbildung 6 b), die nicht waren. Es bestätigte auch das Vorhandensein einer genomischen Kontaminanten in der Niere, Lunge und HUVEC Proben. Noch wichtiger ist, bestätigt sie die Expression von V2R in Niere, Lunge und HMVEC-L, aber nicht in HUVECs. Die Expression von V2R in HMVEC-L und der menschlichen Lunge. (A) RT-PCR-Amplifikation aus humaner Niere, HMVEC-L, HUVECs und menschliche Lungen polyA +. Das erwartete 857-bp-Fragment (Pfeil) wurde von V2R mRNA-Primer V2Rc und V2Rd verstärkt werden. Die RT-PCR-Reaktion wurde in Abwesenheit oder Anwesenheit von RT durchgeführt. Erste Spur: HindIII / EcoRI-Lambda-Marker. Das Gel wurde mit Ethidiumbromid gefärbt. (B) Southern-Blot-Analyse der RT-PCR-Produkte von Niere, Lunge, HUVECs und HMVEC, eine Sonde von V2R cDNA abgeleitet werden. Negativkontrolle: RT-PCR-Reaktion in Abwesenheit von Matrize durchgeführt. Der Pfeil zeigt V2R Transkript (857 bp); die Band sichtbar nur repräsentiert über genomische DNA V2R. Fünfmal weniger der RT-PCR-Reaktion wurde sowohl auf das Gel geladen für Nieren und der Lunge im Vergleich mit HUVECs und HMVEC-L. (C) RT-PCR-Amplifikation von umgekehrt transkribiert polyA + RNA von humanem Lungen von zwei verschiedenen Spendern (Spuren 3 und 4) unter Verwendung von Primern STV2 und V2R Bam HALLO. Die RT-PCR-Reaktion wurde ohne (Spuren 3 und 4) oder mit vorheriger Vorbehandlung der Proben mit RNase-freie DNaseI (Spur 5) durchgeführt. Die Größe des Fragments erwartet von V2R mRNA amplifiziert werden soll, 1144 bp, wie durch Amplifizierung von Plasmid-DNA überprüft das Volllängen-codierende Region des V2R (Spur 2) trägt. Spur 1: RT-PCR-Amplifikation von DNA-Plasmid, das die genomische DNA des V2R (erwartete Größe: 1.611 bp) beherbergt. Das Gel wurde mit Ethidiumbromid gefärbt. Identifizierung von voller Länge und alternativ gespleißte Transkripte V2R aus humanem Lungen polyA + RNA durch RT-PCR. Schließlich haben wir uns für die Expression von V2R in ganzen menschlichen Lunge. Wir konnten zwar detektieren eine etwa 860-bp-Bande aus Lungen polyA + mRNA (6 a), die durch DNA-Sequenzierung V2R werden konnte gezeigt. Unter Verwendung anderer Primer (STV2 und V2R Bam HALLO) so dass für die Amplifikation der gesamten Sequenz von V2R, erhalten wir vier Fragmente unterschiedlicher Größe (etwa 1.100 bp, 700 bp, 440 bp und 240 bp) aus der menschlichen Lungen-polyA + RNA von zwei verschiedenen Spendern (Abbildung 6 c, Spur 3 und 4). Nach der Vorbehandlung der menschlichen Lunge polyA + RNA mit RNase-freier DNase I vor der RT-PCR (Bahn 5), wurden nur drei Fragmente (etwa 1.100 bp, 700 bp und 240 bp) identifiziert, was darauf hinweist, dass die Bande bei 440 bp ergab sich aus genomische Kontamination. Klonierung und Sequenzierung der PCR-Fragmente zeigte, dass die Bande bei etwa 700 bp keine V2R-spezifische Sequenz beherbergen hat. Das 1100-bp-Fragment repräsentiert die volle Länge V2R Transkript, während die Bande bei 240 bp von alternativem Spleißen innerhalb des V2R-Gens (nicht veröffentlichte Beobachtungen) geführt. Somit V2R mRNA wird in ganze Lunge sowie in HMVEC-L gefunden. DDAVP wird gedacht, um Plasma vWF Ebenen durch erhöhte Exozytose von WP Körper erhöhen.